一 细胞培养的概念:指从体内取出组织、细胞制成单个细胞悬液 在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使其生存和生长，并维持其结构和功能特性，继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。也可用已建系的细胞株（系）复苏后继续培养，多是癌细胞。 目的：进行后续的生命科学研究。
二培养细胞进行科研的优点：㈠研究的对象是活的细胞。 ㈡研究的条件可以人为的控制。 ㈢研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤研究的范围比较广泛。 ㈥研究的费用相对较经济。
三影响细胞生长的因素
1无毒无污染的细胞培养环境
2恒定的生长温度
3合适的气体环境
4ph缓冲环境
5理想的渗透压
6湿度和光
7影响细胞生长的其他因素
四．细胞培养过程中常见的污染来源和污染类型有哪些？叙述各污染类型的特征。
污染来源有（一）不洁净空气（二）消毒不彻底（三） 操作不当（四）不洁组织标本（五）使用污染血清.
污染类型有：（一） 细菌污染（二）霉菌污染（三） 病毒污染（四） 支原体污染（五） 交叉污染
（一）细菌污染的特征（1）多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生（2）常见污染细菌：大肠埃希菌、假单孢菌、白色葡萄球菌、枯草杆菌等（3）培养液变化：混浊，pH降低，颜色变黄（4）由于细菌增殖迅速，发生污染48h以内就很明显细菌污染易发现
（二）真菌污染的特征（1）较常见，炎热潮湿的季节多发（2）真菌种类繁多：烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、孢子霉菌、白念色珠菌、酵母菌等（3）培养液变化：呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见（4）镜下观察：丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。（5）真菌生长迅速，短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞真菌污染不难发现
（三）病毒污染的特征（1）病毒寄生有种属特异性，污染的概率相对其他微生物较小（2）病毒颗粒微小，污染难于发现，一般的实验室都没有能力检查 3）以前病毒的形式整合在细胞染色体上，或以质粒形式存在于胞质中，随细胞分裂传到子代细胞，导致细胞发生变异、转化，形成异倍体细胞系（4）潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题（5）还会对进行某种未知病毒分离鉴定造成干扰
（四）支原体污染的特征（1）最常见，培养液中加入的血清通常是支原体污染的来源（2）支原体：能独立生活的最小微生物，直径0.2～2μm，无细胞壁，形态多样，有圆形、丝状或梨形，可通过滤菌器，一般过滤除菌无法去除（3）适于偏碱条件下（pH7.6～8.0）生存，对酸耐受性差，对热敏感，对青霉素抗药（4）培养基变化：pH不变，培养液不混浊，培养的细胞形态无明显变化，外观上似“正常”（5）影响：DNA合成、代谢减慢、生长抑制
（五）细胞交叉污染（1）原因：各种细胞同时培养，混杂使用器具或液体（2）有些变化较轻微、不易察觉（3）严重时，污染的细胞优势生长，培养的目的细胞生长受抑，最终死亡目前世界上已有几十种细胞都被Hela细胞所污染，许多实验宣告无效
（六）化学和物理性污染 最常见的化学性污染：玻璃制品清洗残留的变性剂、肥皂未纯化的试剂、水、血清、生长辅助因子也都是化学性污染的来源培养环境中的物理因素：放射线、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响一般来说，这两种污染较少发生，在操作过程中只要细心，很容易避免
七贴附和铺展的意义
（1）贴附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求 细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能 否成功的第一步.
（2）细胞悬浮后，耽搁得越久，越容易发生退化
铺展、伸展的意义
（1）铺展状况是调节细胞形状的主要方面，铺展得越好，细胞越扁，细胞与生长基质表面接触面越大。
（2）铺展状况与细胞的生长有密切关系 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，只有当细胞铺展到 合适的程度DNA合成才开始进行。
九 原代细胞的各种分离方法及其原理是什么？
离心法（悬浮细胞）：选用悬液中某些细胞,采用细胞分层液离心，不同比重细胞在分层液的不同层，收获目的细胞.
机械分离法：吸管吹打、电磁搅拌、摇珠瓶中振荡，细胞团块得以充分的分散制成大量单个细胞的细胞悬液
消化分离法：应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，块状变成絮状再采用机械法
十一 叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
悬浮生长细胞的传代：1直接传代法:悬浮细胞自然沉淀瓶底，用吸管吸取上清1/2~2/3，轻轻吹打成细胞悬液，等分装入数个培养瓶
2离心传代法：将细胞悬液转移到离心管内800~1000r/min离心5分钟，弃上清，加新的培养液到离心管内，吸管吹打成为细胞悬液，分瓶培养。
半贴壁细胞的传代：1直接吹打2硅胶软刮刮除法
贴壁细胞的传代：消化法 步骤（1）弃去旧培养液（2）漂洗（3）消化（4）吹打（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养
十二简述体外培养细胞的生命期及各期特点。
定义：细胞在体外培养过程中持续增殖和生长的时间。
正常培养细胞生存过程，大致都经历三个阶段：（一） 原代培养期（二传代期（三）衰退期
（一）原代培养期（Primary Culture）
定义：也称初代培养，从体内取出组织接种培养到第一次 传代，一般持续1~4周
特点：
（1）原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。 细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛
（2）细胞群是异质的（Heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相 同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂 培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即 细胞独立生存性差
（3）原代培养细胞多呈二倍体核型
（4）和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象
（二）传代期
初代培养细胞，当生长达一定密度后，都需做传代处理, 培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的, 当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部
分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这 一过程叫传代（Passage或Subculture）
传代期细胞特点：
1. 在全生命期中传代期的持续时间最长
2. 在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二 倍体核型，称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）
3. 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期
（三）衰退期
细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡
在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）
十三冷冻保护剂的种类和作用原理。
定义：保护细胞免受冷冻损伤的物质
保护机制：
1. 与溶液中水分子结合，使溶液粘性增加，冰点下降，弱化水的结晶过 程，减少冰晶形成
2. 维持细胞内外一定的电解质浓度，减少溶质损伤
除红细胞、微生物、极少数有核哺乳动物细胞外，大 多数有核细胞都需冷冻保护剂
种类 ：（1） 渗透性保护剂：甘油、二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇
属低分子中性物质，易与溶液中水分子结合，易于穿透细胞
（2）. 非渗透性保护剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP），蔗糖、
聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。 属大分子物质，不能穿透细胞 冰晶形成之前，优先结合溶液中水分子 降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量
十四 细胞冻存和复苏过程中，为什么要尽可能防止冰晶形成？防止冰晶形成的措施有哪些？
冰晶损伤细胞的机制：胞内冰晶损伤：胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁、细胞膜及胞核DNA空间构型发生不可逆损伤，甚至导致细胞死亡 溶质性损伤：胞外的水分结冰，导致细胞外溶液浓度升高并持续较长时 间，由高渗引起细胞损伤对一定种类细胞的冻存、复苏过程，这两种损伤几乎同时存在：降温较慢时，以溶质性损伤为主 降温较快时，以胞内冰晶损伤为主
冰晶对细胞的损伤：
1. 对细胞造成机械损伤，胞内冰晶还可导致超微结构的破坏
2. 细胞外冰晶导致细胞内脱水，电解质浓集，蛋白质变 性、沉淀
3. 溶液渗透压和pH值变化对细胞形成损伤
防止冰晶形成的措施：
1程序化冷冻（慢冻-速溶法）2.加入冷冻保护剂3.玻璃化冷冻4.抗冻蛋白的应用5.静电场的引入
十五．培养细胞纯化的方法有哪些？
（一） 自然纯化（二）人工纯化
（一）自然纯化利用某类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰，不断排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。留下的细胞：成纤维细胞、突变细胞、肿瘤细胞
（二）人工纯化利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长达到纯化细胞目的 方法：1. 胰蛋白酶消化法2. 机械刮除法3. 反复贴壁法4. 电烙筛选法5. 克隆法6. 细胞因子依赖纯化法7. 其他
十七试述细胞凋亡的检测方法及各方法的原理。
1.细胞凋亡的形态学检测
（1）光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体
染色细胞：凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围
（2）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况
（3）电子显微镜观察
2. 磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（Annexin V法）
ps正常位于细胞膜的内侧，凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，
将Annexin-V进行荧光素标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生
3.线粒体膜电势能（DYmt）的检测
（1.）线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质
（2.）线粒体荧光染料对线粒体膜电位非常敏感
（3.）其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低
4.DNA片段化分析
细胞凋亡染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。也可用流式细胞仪分析细胞核DNA
5.TUNEL测定法
TUNEL：脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling）
原理：
细胞凋亡时，內切酶（endonucleases）切断DNA ，使3’-OH端暴露出来
标记物接上DNA 3’-OH端
用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应
DNA断裂点越多， 标记物结合越多
6.caspase-3活性测定
caspase-3是促进细胞凋亡的蛋白质，其活性增强，凋亡就极有可能被诱发
7.Caspase-3 的Western Blot检测法
8.Caspase-3裂解PARP法
二十熟悉培养细胞活力检测的方法。
细胞活力： 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡 的细胞；活细胞中生理活动和代谢能力也 有差别。
（一）活细胞百分率检测法
染色：一般0.5%～1.0%台盼蓝，活细胞拒染，死细胞染成蓝色 细胞存活率=[拒染细胞数/（拒染细胞数+着色细胞数）]×100%
（二） MTT法
原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在 细胞中，而死细胞无此功能 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，在490nm波长处测定其光吸收值，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比， 间接反映代谢正常活细胞数量
（三） XTT法
原理：作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物，水溶性甲臢吸光度与活细胞的数量成正比
（四） CCK-8法（或称WST-8法）
原理：被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢产物，生成的甲臢的量与活细胞的数量成正比
（五）考马斯亮蓝测定法
原理：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其光吸收值与蛋白质含量呈正相关
（六）3H-亮氨酸掺入法
原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用同 位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白质合成 代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白 质合成代谢状况
（七）3H-TdR掺入法
原理： 用同位素3H标记胸腺嘧啶核苷（ TdR）即3H-TdR 作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定 细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况
二十一试述细胞增殖生长状况相关指标的检测方法及各方法的原理。
（一）细胞计数
测定培养基、血清、药物等对细胞生物学影响的重要手段
（二）细胞生长曲线和倍增时间
生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞 绝对增长数值和细胞增殖基本规律常用的简便方法 只有具备自身稳定生长特性的细胞才适用于细胞生长变化的实验。
倍增时间（doubing time，DT）
在生长曲线上细胞数量增加一倍所需时间 倍增时间区间即对数生长期，细胞传代、实验应在此区间进行 倍增时间计算方法：
（三）细胞分裂指数
分裂细胞占全部细胞百分比，表示细胞增殖旺盛程度
（四）细胞贴壁率
又称贴壁细胞存活率，适用于观察贴壁附着细胞的生存能力 和部分底物材料的生物相容性
（五）克隆形成率
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细 胞弱，转化细胞系强；正常细胞低，肿瘤细胞强
（六）细胞增殖周期：利用培养细胞来研究细胞动力学、细胞的DNA合成代谢和有丝分裂 抗肿瘤药物的作用机制研究
附加题：熟悉细胞核的分离技术和细胞脱核技术相关内容。
细胞核的分离是研究基因表达及细胞和形态结构的首要步骤，不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，全部操作必须在冰浴中进行，所用溶液需预冷。
细胞脱核指采用化学或物理方法把细胞核从细胞中分离出来，形成无核的胞质体( Cytoplast )和无胞质的核质体(Nucleoplast) 是一项经典的细胞生物学技术 可用做各项研究，细胞融合、胞质、胞膜、胞核的成分分析以 及开展染色质基因转移技术等.
脱核原理：细胞松驰素B（Cytochalasins B，CB）是肌动蛋白聚合的抑制剂 ，细胞在CB的作用下，微丝聚集受到抑制，细胞核 与细胞质间连接变得松散。在离心力的作用下，细胞核从细 胞中脱出，从而得到去核细胞.
二十二细胞DNA、RNA和蛋白质提取方法有哪些，其中核酸提取应注意哪些方面？
1.单一组分提取方法：
2.多组分同时提取方法：TRIzol试剂
能迅速破碎细胞，使样品匀浆化，溶解细胞内含物，抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性,非常适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA,同时有RNA、DNA和蛋白多组分分离作用.
核算提取应注意：（1）保证结构的完整性
（2）排除其他大分子的污染（蛋白质、多糖等）
（3）提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
二十三RNA提取过程中为什么要避免RNase污染，预防RNase污染的注意事项有些？
RNase是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定，在极端的条件可暂时失活，因素去除后又迅速复性。高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白质抑制剂不能使所有的RNase完全失活，广泛存在于皮肤上
（1）必须戴手套，且经常更换
（2）RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
（3）配制溶液应使用无RNase的水
二十四 试述FCM检测的基本原理及其在临床和科研中的应用。
将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。
流式细胞术在临床中的应用.白血病分型 淋巴细胞亚群分析
生物医学科研中的应用1.研究课题中的细胞生物学指标2.免疫功能紊乱与疾病的相关性3.干细胞研究4.某特定细群5.血细胞分化、发育研究6.细胞因子及受体测定7.药物动力、药效分析
二十五叙述蛋白免疫印迹技术（Western Blot）的原理和简要的操作步骤。
原理：Western Blot技术是一种蛋白质的固定和分析技术，采用的是聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如 硝酸纤维素薄膜）上。
固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，能与特异性抗体结合。第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗来测，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分
步骤：（1）生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白
（2）SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离
（3）蛋白质条带原为转移到固相膜上
（4）将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点
（5）加入一抗，膜上的抗原与一抗结合后，再加入带标记的二抗
（6）通过特异性反应显色进行检测
二十七 密度梯度离心中速率—区带离心和等密度离心原理分别是什么？
最主要的区别在哪里？
速率区带离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法
等密度离心原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离
区别:等密度离心的离心介质、密度梯度范围与速率—区带离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内，介质梯度不需预先制备
